les différents types de centrifugation :
1.
Le coefficient de sédimentation
Lors d’une
centrifugation, la vitesse de sédimentation d’une particule va être fonction de
sa masse, de son volume et de la densité du solvant (ce qui détermine la
poussée d’Archimède), de l’accélération à laquelle elle est soumise, mais
également aux forces de frottement liées à son déplacement dans la solution,
forces qui vont dépendre de la taille et de la forme de la particule. La
vitesse de sédimentation fait donc intervenir de nombreuses variables, c’est
pourquoi elle n’est pas calculée mais mesurée expérimentalement. On mesure donc
un coefficient de sédimentation exprimé en Svedberg (S) qui correspond à 10-13 s.
Plus la valeur est élevée, plus la vitesse de sédimentation est importante.
Pratiquement, on mesure la vitesse de déplacement d’un front de migration de la
particule étudiée.
2.
La centrifugation différentielle
Dans ce type
de centrifugation, le principe est de séparer les différents constituants le
plus souvent à l’aide de plusieurs cycles de centrifugation à accélération
croissante. Dans une première centrifugation à faible accélération, les
éléments les plus massifs vont sédimenter et former un culot au fond du tube.
Tous les autres éléments (pour lesquels l’accélération a été trop faible pour
contrebalancer les effets de l’agitation moléculaire, ou pour lesquels le temps
de centrifugation a été trop court) vont rester dans la fraction liquide
appelée alors surnageant. On récupère alors séparément le surnageant et le
culot ce qui revient à avoir séparé les constituants qui les composent. Cette
méthode est par exemple couramment utilisée pour récupérer les éléments figurés
(les cellules) du sang qui sédimentent pour des accélérations très faibles
(quelques dizaines de g).
Au besoin,
on peut recommencer un second cycle de centrifugation avec le surnageant
précédent, mais avec une accélération plus importante. Progressivement, on
sépare ainsi les différents constituants en terminant par les éléments les plus
petits et ayant le moins de différence de densité avec le solvant. Précisons
que les fractions obtenues sont généralement loin d’être pures, d’autant que
les échantillons initiaux sont souvent complexes (exemple du broyat total d’un
tissu). L’intérêt est justement de pouvoir traiter des échantillons très
complexes, et ce sur des volumes importants avec des rotors adaptés.
Le choix des
accélérations dépend du matériel à traiter. Le plus souvent, il y a une phase
de mise au point permettant d’adapter le protocole à partir des données de la
littérature. Une fois mis au point, le protocole est utilisé dans un but
préparatif. La figure 4 dresse une liste non exhaustive des constituants
cellulaires et des valeurs d’accélération nécessaires pour les faire
sédimenter.
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Valeurs indicatives des conditions
de sédimentation pour quelques constituants
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Constituant cellulaire
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Conditions de
sédimentation
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Noyau
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10 minutes à 500 g
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Mitochondries, lysosomes,
peroxysomes
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10 minutes à 5 000 g
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Réticulum endoplasmique, appareil
de Golgi
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1 heure à 100 000 g
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Ces valeurs peuvent
varier en fonction du matériel utilisé, la composition des membranes pouvant
en particulier modifier la densité des constituants. On constate que des
constituants différents sédimentent approximativement dans les mêmes
conditions. Pour pouvoir les séparer il faut d’autres méthodes, par exemple
une centrifugation à l’équilibre sur gradient de saccharose (voir ci-dessous)
qui permet de séparer les différents compartiments de l’appareil de Golgi (on
parle plutôt de fractions enrichies).
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3.
La centrifugation à l’équilibre
Exemple de
gradient discontinu
L'échantillon
a été représenté au sommet ce qui suppose qu'il soit moins dense que la
première couche de solution de saccharose. Il arrive que l'on place l'échantillon
au fond, au besoin en ayant au préalable augmenté sa densité en ajoutant du
saccharose (par exemple).
Dans une
centrifugation à l’équilibre, les différents constituants atteignent une
position dont ils ne vont plus bouger, car étant en équilibre. Or l’équilibre
est atteint lorsque la densité d’une particule est égale à la densité du
solvant, ce qui entraîne que la force gravitationnelle est égale à la poussée
d’Archimède. On va donc utiliser un solvant dont la densité va varier en
fonction de la position dans le tube, permettant aux différents constituants de
rejoindre la zone de densité équivalente à la sienne : on parle de gradient.
Pour obtenir des solutions de densités différentes, la méthode la plus
classique est d’utiliser des solutions de concentration croissante en
saccharose, mais on utilise aussi du chlorure de césium. D’autres molécules
sont aussi utilisées mais beaucoup plus marginalement.
Exemple de
gradient continu
Le gradient
peut être linéaire, mais aussi exponentiel ou logarithmique, selon les besoins.
On le coule en faisant varier en continu le débit de deux pompes qui mélangent
deux solutions, l'une à 10% et l'autre à 60% de saccharose, dans le cas
présent.
Il existe
deux types de gradients : discontinus et continus. Dans les deux cas la vitesse
de sédimentation ne doit pas intervenir. Il est donc nécessaire de laisser le
temps aux particules d’atteindre leur position d’équilibre, ce qui implique des
temps de centrifugation assez longs. Bien entendu, les particules les moins denses
peuvent se retrouver au sommet du tube (particules moins denses que la solution
la plus haute) et les particules les plus denses peuvent former un culot
(particules plus denses que la solution la plus basse). Le contenu du tube peut
être récupéré par fractions successives, souvent du bas vers le haut, pour
utilisation et/ou analyse ultérieure.
- Les gradients discontinus sont
constitués d’un empilement de solutions de moins en moins dense (voir Fig.
5). Les différents éléments s’accumulent aux interfaces entre les
solutions de densité différentes. Au-dessus, leur densité étant plus
élevée, ils migrent vers le bas, et au-dessous, leur densité étant plus
faible, ils migrent vers le haut. Il arrive de limiter le gradient à deux
densités seulement avec une solution inférieure très dense. On peut alors
utiliser ce gradient minimaliste pour une centrifugation différentielle.
La différence est qu’au lieu de former un culot, les éléments les plus
denses resteront en phase liquide. Cette méthode est donc beaucoup plus
douce que la formation d’un culot (qui impose entre autre de
resolubiliser) c’est pourquoi on parle de « coussin ».
- Les gradients continus pour
lesquels la variation de densité est continue (comme leur nom l’indique ;
voir Fig. 6). Les différents constituants vont alors migrer jusqu’à
atteindre le point précis où leur densité est égale à celle du solvant,
formant des bandes parfois visibles à l’œil nu (diffusion de la lumière).
l'importance du phénomène de sédimentation dans l'analyse
moléculaire :
- En physique-chimie, la sédimentation (décantation) est aussi l'un des procédés de séparation des mélanges. Il consiste à laisser se sédimenter
les particules en suspension dans le liquide pour pouvoir les séparer.
C'est un principe utilisé par certaines stations d'épuration de l'eau (bassin de décantation).
- En biochimie, il s'agit de la séparation
de protéines en solution qui ont la
capacité de sédimenter dans un champ centrifuge élevé. On pratique l'ultracentrifugation et dans ce cas les molécules sont mises en mouvement et
sédimentées par suite de leur densité qui est supérieure à celle
du solvant, on peut donc déterminer
différentes macromolécules et déterminer leur masse molaire ainsi que leur constante
de sédimentation mesurée en Svedberg
l'influence du temps sur la
centrifugation
Le processus cinétique de sédimentation peut prendre du temps
(jusqu’à plusieurs mois, voire plusieurs années pour certains produits). le
formulateur peut être intéressé par des méthodes d’accélération ou des outils
de caractérisation plus sensible que l'observation visuelle (technique de
diffusion de la lumière, acoustique...). Les mécanismes de séparation de phase
sont provoqués par plusieurs phénomènes que l'on peut simplifier en deux
catégories, la gravitation et la diffusion. Les méthodes thermiques consistant
à stocker l'échantillon à une température supérieure à la température de
stockage permettent d'augmenter les phénomènes de diffusion.La température ne
doit pas excéder les températures critiques d’inversion de phase et de
dégradations chimiques. L'élévation de la température permet également de
simuler les conditions de stockage différents en fonction des saisons et lieu.
Elle affecte la viscosité, mais également la tension interfaciale dans le cas
des tensioactifs non-ioniques et plus généralement les forces d’interactions à
l’intérieur du système. L'usage raisonné et éclairé de la centrifugation, de
même que l'usage de la température requiert de rester en deçà des points
critiques.
La force centrifuge et le
poids s'exerçant sur un objet de masse m sont deux forces qui sont
proportionnelles à m, (selon le principe
d'équivalence). Aussi, est-il souvent plus évocateur de
considérer, non pas les forces F, mais les accélérations F/m.
L'accélération est une
grandeur cinématique, dont l'unité SI est le mètre par seconde carrée, (m/s2).
On peut également utiliser
le nombre
de g, défini par le rapport entre l'accélération considérée
et l'accélération de la pesanteur terrestre,
laquelle est environ 9,81 m/s2.
En langage courant, le
nombre de g est donc le dixième de la valeur de l'accélération exprimée en m/s2.
