la technique immunohistochimie
Sommaire :
1)-Introduction
2)-Définition
de la technique d’immunhistochimie
3)-Principe
de la technique
4)-Préparation des
anticorps
5)-La méthodes de la
technique
5.1)-Les techniques
directes
5.2)-Les méthodes
immunoenzymatique indirectes
6)-Les marquages
7)-Etude
immunohistochimie sur cancer du sein
7.1)-Définition de cancer
du sein
7.2.1)- détection des
récepteurs hormonaux
7.2.2)- lecture des lames
après immunohistochimie
7.2.3)- résultats des RO (
récepteurs ostrogénique)
8)-Conclusion
1)-Introduction :
L’histochimie
est l’étude de la composition chimique des cellules, des divers tissus vivants
(épithélium de revêtement, glandulaires, musculaires, conjonctifs et osseux,
sang et lignées hématopoïétique ) et des réactions chimiques cellulaires et
tissulaires au cours des processus métaboliques. L’histochimie regroupe de très
nombreuses techniques qui peuvent caractériser les constituants de la cellule
(métaux, enzymes, acides nucléiques, glucides, lipides, protéines,
etc..).(d’après Marc Maillet et al ).
Nous avons
plusieurs méthodes de l’histochimie :
·
Méthode non-spécifique :
ü Acide
Périodique-Schiff (APS).
ü Test de feulgen.
ü Incorporation de
Précusseurs Radioactifs.
·
Méthode spécifique :
ü Immunohistochimie(IHC).
ü Hybridation in
situ(HIS).
ü Histoenzymatique.
Dans notre
exposé nous avons voir la méthode spécifique d’immunohistochimie(IHC). (d’après
moi).
2)-Définition de la technique d’immunhistochimie :
L’immunohistochimie
est une technique associant l’immunologie et l’histochimie, elle permet de
localiser et d’identifier des protéines.
Le domaine
d’application est très vaste en anatomie et cytologie pathologie étudiant les
tissus présentant des altérations lésionnelles. Cette technique apporte une
aide au diagnostic en pathologie tumorale et nom tumorale, une aide à
l’établissement du pronostic en pathologie tumorale. Elle est utilisée de façon
journalière dans les laboratoires et connait un développement accru par
l’apparition de méthodes de démasquage antigénique, la commercialisation de
nombreux anticorps intéressant des domaines très variés et de systèmes
d’amplification de plus en plus performants, permettant de révéler de beaucoup
plus faibles quantités d’antigène et ce, après traitement classique des
cellules ou tissus par fixation et inclusion en paraffine.
Cet
important développement élargit le domaine de la recherche dans l’étude des
mécanismes physiopathologiques des maladies en pathologie humaines et
expérimentales.
Le schéma technique est le suivant :
3)-Principe de la technique :
Le but de
l’immunohistochimie est de mettre en évidence certaines protéines cellulaires,
qu’elles soient cytoplasmique. Membranaires ou nucléaires, spécifiques pour un
type ou une fonction cellulaire, à l’aide d’une réaction antigène-anticorps, li
complexe formé étant rendu visible, donc localisable, par un marqueur coloré.
Le réactif
principal est un anticorps spécifique dirigé contre ce motif. Un traceur fixé
directement ou indirectement sur l’anticorps permet de détecter la liaison
entre l’anticorps et sa cible.
4)-Préparation des anticorps :
Un anticorps spécifique de
l’antigène (protéine) à étudier, est préparé par injection de cet antigène
purifie à un animal appartenant à une autre espèce que celle dont on a extrait
l’antigène injecté. l’animal traité développe une réaction immunologique: des
macrophage phagocytent la protéine, la fragmentent en peptides et les exposent
à leur surface grâce au CMH 2 (complexe majeur d’histocompatibilité de type 2).
Les peptides sont présentés aux lymphocytes T activent ensuite les lymphocytes
B qui se transforment en cellules productrices d’anticorps, les plasmocytes.
L’anticorps ainsi obtenu se fixe sur la protéine qui est à l’origine de sa
fabrication.( d’après Marc Maillet et al)
5)-La méthodes de la technique :
Il existe principalement
deux méthodes concernant l’immunohistochimie et la détection d’antigènes au
sein des tissus biologiques :
5.1)-Les techniques
directes utilisent des anticorps couplée
à la fluorescéine et sont employée surtout sur tissu congelés, pour le
recherche de dépôts extra cellulaire.
Exemple : immunofluorescence sur une biopsie rénale
congelée.
5.2)-Les méthodes
immunoenzymatique indirectes, l’AC
spécifique primaire et déposé sur le tissu, puis il est révélé par une 2éme AC
couplé à une enzyme à la quelle on fournit son substrat. Le produit coloré de
la réaction enzymatique apparait au niveau du site des complexes Ag-Ac.
Exemple : immunohistochimie de l’insuline dans un ilot
de langerhans (technique d’immunophoxydase sur tissu pancréatique fixé et
déparaffiné.
7)-Etude immunohistochimie sur cancer du sein :
7.1)-Définition de cancer
du sein :le cancer du sein est plus fréquent des cancers chez
les femmes. on estime qu’une femme sur 11 sera touchée par ce cancer au cours
de sa vie. trés rarement, le cancer du sein peut toucher aussi les hommes (1%
des cas).
On distingue plusieurs types
de cancers du sein. parmi les deux plus fréquent : le cancer non invasif
qui se forme à l’intérieur des canaux de loctation du sein et cancer invasif
qui touche les tissus autour de ces canaux. Ce dernier a plus de risque de
s’étendre dans le sein et à d’autre organes s’il n’est pas pris en charge
rapidement. Dans tous les cas, dépisté tôt, le cancer du sein se soigne très
bien et il n’est forcément nécessaire d’enlever tout le sein atteint.
7.2.1)- détection des
récepteurs hormonaux :
des
coupes de tissus tumoraux sont étalées sur des lames prétraitées pour une
adhésion maximale du tissu au support, puis incubées pendant 60 min à 58 C° et
pendant une nuit à 37 C°. le reste de la paraffine est éliminé par deux
passages dans les bains de toluène (5min chacun) . les lames sont ensuite
plongées dans trois bains d’alcool à
concentration décroissances(5min chacun) et réhydratées par un rinçage à l’eau
courante(10min).l’inhibition des peroxydases endogènes est obtenue après
incubation des coupes histologique avec
une solution de peroxyde d’hydrogène à 0.4% pendant 15 min ; puis un
démasquage antigénique est réalisé en portant à ébullition les coupes
histologique dans une solution de tampon citrate(PH=6) pendant 5 min. Après
refroidissent, les coupes sont trempées dans une solution de PBS(phosphate
buffered saline) pendant 5min, puis elles sont incubées pendant 15min avec la
protéine bloquante, ensuite pendant 1h20min avec l’anticorps primaire.après rinçage
au PBS, l’anticorps secondaire biotinylé est appliqué d’abord pendant 20 min
puis le complexe de peroxydase-streptavidine est appliqué pendant 20min avec
rinçage au PBS entre les deux applications(5min chacun).pour révéler la
réaction immunohistochimie l’échantillon est recouvert pendant exactement 10min
d’un réactif de coloration préparé extemporanément en mélangeant 2 gouttes de
chromogène à5 ml d’amino-éthyle-carbazole (AEC).après rinçage a l’eau
courante(10min), les lames sont incubées dans un bain d’hématoxyline pendant
1min30s, rincées à l’eau puis passées rapidement dans du carbonate de lithium
saturé avant rinçage à l’eau distillée. Enfin, montage des coupes entre lame et
lamelle en utilisant un milieu aqueux spécifique à l’AEC.
7.2.2)- lecture des lames
après immunohistochimie :
Les récepteurs aux
œstrogènes et la progestérone sont considérés positifs lorsque plus de 10% des
noyaux des cellules tumorales étaient marqués, quelle que soit l’intensité du
marquage( Awada et al,2005 ;Doweseft et al ;2008).actuellement,
le seuil fixé à 1% est introduit dans les recommandations
nord-américaines(Hammond et al :2010).
7.2.3)- résultats des RO (
récepteurs ostrogénique) :
La figure 04 montre que
90.91% de la population ont un RO positif, alors que 9.09% de la population ont
un RO négatif, on précise qu’un RO est positif lorsque plus de 10 % des noyaux
des cellules tumorales sont marqués. L’aspect de ces noyaux est illustré par la
figure 05 qui montre un exemple de résultat microscopique d’un cas RO positif.
ces patientes ayant des récepteurs des œstrogènes pourront subir un traitement
hormonal.
8)-Conclusion :
Les principaux avantages de cette
technique sont sa sensibilité, sa spécificité, et la facilité de sa mise en
œuvre. De plus, elle permet par une approche morphologie, de préciser la
répartition des motifs d’intérêt dans un tissu et de localiser le signal dans
les differents compartiments cellulaires.
L’observation est réalisée à
l’aide d’un microscope optique conventionnel ou à épi fluorescence pour les
traceurs fluorescents. elle peut être appliquée à des coupes de tissu fixé, à
des cryocoupes, ou des préparations cellulaires de diverse nature.
La coloration obtenue est
stable, permettant archivage et études rétrospectives la qualité du signal
obtenu est généralement meilleure à partir de tissu fixé cependant la plupart
des fixateurs comportent un risque de modification, de marquage ou d’altération
de l’épitope d’intérêt.
Les références bibliographiques:
Marc
Maillet, Michel Lemullois, christiane Maillet, 2006.biologie cellulaire.10ème
éd .,paris.
M.BENTAHAR
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Dr I
Rouquette ; novembre 2015; l’immunohistochimie la FISH et autres ISH pour,
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MD1.,konecny GE, O ‘call afghan C, Berry M, pieteras R,Slamon DJ(2014)Rationnal
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Inst.19 ;96(10) ;739-49.
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