les différents types de centrifugation :

les différents types de centrifugation :

1.    Le coefficient de sédimentation

Lors d’une centrifugation, la vitesse de sédimentation d’une particule va être fonction de sa masse, de son volume et de la densité du solvant (ce qui détermine la poussée d’Archimède), de l’accélération à laquelle elle est soumise, mais également aux forces de frottement liées à son déplacement dans la solution, forces qui vont dépendre de la taille et de la forme de la particule. La vitesse de sédimentation fait donc intervenir de nombreuses variables, c’est pourquoi elle n’est pas calculée mais mesurée expérimentalement. On mesure donc un coefficient de sédimentation exprimé en Svedberg (S) qui correspond à 10^-13 s. Plus la valeur est élevée, plus la vitesse de sédimentation est importante. Pratiquement, on mesure la vitesse de déplacement d’un front de migration de la particule étudiée.

2.    La centrifugation différentielle

Dans ce type de centrifugation, le principe est de séparer les différents constituants le plus souvent à l’aide de plusieurs cycles de centrifugation à accélération croissante. Dans une première centrifugation à faible accélération, les éléments les plus massifs vont sédimenter et former un culot au fond du tube. Tous les autres éléments (pour lesquels l’accélération a été trop faible pour contrebalancer les effets de l’agitation moléculaire, ou pour lesquels le temps de centrifugation a été trop court) vont rester dans la fraction liquide appelée alors surnageant. On récupère alors séparément le surnageant et le culot ce qui revient à avoir séparé les constituants qui les composent. Cette méthode est par exemple couramment utilisée pour récupérer les éléments figurés (les cellules) du sang qui sédimentent pour des accélérations très faibles (quelques dizaines de g).

Au besoin, on peut recommencer un second cycle de centrifugation avec le surnageant précédent, mais avec une accélération plus importante. Progressivement, on sépare ainsi les différents constituants en terminant par les éléments les plus petits et ayant le moins de différence de densité avec le solvant. Précisons que les fractions obtenues sont généralement loin d’être pures, d’autant que les échantillons initiaux sont souvent complexes (exemple du broyat total d’un tissu). L’intérêt est justement de pouvoir traiter des échantillons très complexes, et ce sur des volumes importants avec des rotors adaptés.

Le choix des accélérations dépend du matériel à traiter. Le plus souvent, il y a une phase de mise au point permettant d’adapter le protocole à partir des données de la littérature. Une fois mis au point, le protocole est utilisé dans un but préparatif. La figure 4 dresse une liste non exhaustive des constituants cellulaires et des valeurs d’accélération nécessaires pour les faire sédimenter.

Valeurs indicatives des conditions de sédimentation pour quelques constituants
Constituant cellulaire	Conditions de sédimentation
Noyau	10 minutes à 500 g
Mitochondries, lysosomes, peroxysomes	10 minutes à 5 000 g
Réticulum endoplasmique, appareil de Golgi	1 heure à 100 000 g
Ces valeurs peuvent varier en fonction du matériel utilisé, la composition des membranes pouvant en particulier modifier la densité des constituants. On constate que des constituants différents sédimentent approximativement dans les mêmes conditions. Pour pouvoir les séparer il faut d’autres méthodes, par exemple une centrifugation à l’équilibre sur gradient de saccharose (voir ci-dessous) qui permet de séparer les différents compartiments de l’appareil de Golgi (on parle plutôt de fractions enrichies).

3.    La centrifugation à l’équilibre

Exemple de gradient discontinu

L'échantillon a été représenté au sommet ce qui suppose qu'il soit moins dense que la première couche de solution de saccharose. Il arrive que l'on place l'échantillon au fond, au besoin en ayant au préalable augmenté sa densité en ajoutant du saccharose (par exemple).

Dans une centrifugation à l’équilibre, les différents constituants atteignent une position dont ils ne vont plus bouger, car étant en équilibre. Or l’équilibre est atteint lorsque la densité d’une particule est égale à la densité du solvant, ce qui entraîne que la force gravitationnelle est égale à la poussée d’Archimède. On va donc utiliser un solvant dont la densité va varier en fonction de la position dans le tube, permettant aux différents constituants de rejoindre la zone de densité équivalente à la sienne : on parle de gradient. Pour obtenir des solutions de densités différentes, la méthode la plus classique est d’utiliser des solutions de concentration croissante en saccharose, mais on utilise aussi du chlorure de césium. D’autres molécules sont aussi utilisées mais beaucoup plus marginalement.

Exemple de gradient continu

Le gradient peut être linéaire, mais aussi exponentiel ou logarithmique, selon les besoins. On le coule en faisant varier en continu le débit de deux pompes qui mélangent deux solutions, l'une à 10% et l'autre à 60% de saccharose, dans le cas présent.

Il existe deux types de gradients : discontinus et continus. Dans les deux cas la vitesse de sédimentation ne doit pas intervenir. Il est donc nécessaire de laisser le temps aux particules d’atteindre leur position d’équilibre, ce qui implique des temps de centrifugation assez longs. Bien entendu, les particules les moins denses peuvent se retrouver au sommet du tube (particules moins denses que la solution la plus haute) et les particules les plus denses peuvent former un culot (particules plus denses que la solution la plus basse). Le contenu du tube peut être récupéré par fractions successives, souvent du bas vers le haut, pour utilisation et/ou analyse ultérieure.

• Les gradients discontinus sont constitués d’un empilement de solutions de moins en moins dense (voir Fig. 5). Les différents éléments s’accumulent aux interfaces entre les solutions de densité différentes. Au-dessus, leur densité étant plus élevée, ils migrent vers le bas, et au-dessous, leur densité étant plus faible, ils migrent vers le haut. Il arrive de limiter le gradient à deux densités seulement avec une solution inférieure très dense. On peut alors utiliser ce gradient minimaliste pour une centrifugation différentielle. La différence est qu’au lieu de former un culot, les éléments les plus denses resteront en phase liquide. Cette méthode est donc beaucoup plus douce que la formation d’un culot (qui impose entre autre de resolubiliser) c’est pourquoi on parle de « coussin ».
• Les gradients continus pour lesquels la variation de densité est continue (comme leur nom l’indique ; voir Fig. 6). Les différents constituants vont alors migrer jusqu’à atteindre le point précis où leur densité est égale à celle du solvant, formant des bandes parfois visibles à l’œil nu (diffusion de la lumière).

l'importance du phénomène de sédimentation dans l'analyse moléculaire :

• En physique-chimie, la sédimentation (décantation) est aussi l'un des procédés de séparation des mélanges. Il consiste à laisser se sédimenter les particules en suspension dans le liquide pour pouvoir les séparer. C'est un principe utilisé par certaines stations d'épuration de l'eau (bassin de décantation).
• En biochimie, il s'agit de la séparation de protéines en solution qui ont la capacité de sédimenter dans un champ centrifuge élevé. On pratique l'ultracentrifugation et dans ce cas les molécules sont mises en mouvement et sédimentées par suite de leur densité qui est supérieure à celle du solvant, on peut donc déterminer différentes macromolécules et déterminer leur masse molaire ainsi que leur constante de sédimentation mesurée en Svedberg 

l'influence du temps sur la centrifugation

Le processus cinétique de sédimentation peut prendre du temps (jusqu’à plusieurs mois, voire plusieurs années pour certains produits). le formulateur peut être intéressé par des méthodes d’accélération ou des outils de caractérisation plus sensible que l'observation visuelle (technique de diffusion de la lumière, acoustique...). Les mécanismes de séparation de phase sont provoqués par plusieurs phénomènes que l'on peut simplifier en deux catégories, la gravitation et la diffusion. Les méthodes thermiques consistant à stocker l'échantillon à une température supérieure à la température de stockage permettent d'augmenter les phénomènes de diffusion.La température ne doit pas excéder les températures critiques d’inversion de phase et de dégradations chimiques. L'élévation de la température permet également de simuler les conditions de stockage différents en fonction des saisons et lieu. Elle affecte la viscosité, mais également la tension interfaciale dans le cas des tensioactifs non-ioniques et plus généralement les forces d’interactions à l’intérieur du système. L'usage raisonné et éclairé de la centrifugation, de même que l'usage de la température requiert de rester en deçà des points critiques.

Force et accélération centrifuge  

La force centrifuge et le poids s'exerçant sur un objet de masse m sont deux forces qui sont proportionnelles à m, (selon le principe d'équivalence). Aussi, est-il souvent plus évocateur de considérer, non pas les forces F, mais les accélérations F/m.

L'accélération est une grandeur cinématique, dont l'unité SI est le mètre par seconde carrée, (m/s²).

On peut également utiliser le nombre de g, défini par le rapport entre l'accélération considérée et l'accélération de la pesanteur terrestre, laquelle est environ 9,81 m/s².

En langage courant, le nombre de g est donc le dixième de la valeur de l'accélération exprimée en m/s².